Fermentazione lattica

Un'altra glicolisi anaerobica è la fermentazione lattica, processo metabolico anaerobico di cui si servono molti microrganismi per ricavare energia dai carboidrati, producendo come sottoprodotto l'acido lattico, ossiacido in grado di inibire molti batteri patogeni e il quale è alla base di ogni bevanda fermentata acida.

C6H12O6 => 2C3H6O3 (+ energia)

Le specie che si servono di questa fermentazione sono soprattutto i batteri lattici (LAB), batteri anaerobici aerotolleranti dell'ordine dei lactobacillales, al quale appartengono i generi dei lactobacillus, dei leuconostoc, degli oenococcus e dei pedioococcus. Degno di nota è anche lo streptococcus thermophilus che insieme al l. delbrueckii subsp. bulgaricus, viene utilizzato nell'industria casearia per la produzione di yogurt.

Fermentazione omolattica

Per fermentazione lattica in senso stretto si intende quella omolattica, nella quale viene prodotto solo acido lattico. I lattobacilli che utilizzano questa via metabolica sono chiamati omofermentativi obbligati e sono i seguenti: l. acidophilus, l. delbrueckii, l. helveticus, l. malis, l. salivarius e s. thermophilus.

Alla base di questa fermentazione vi è la glicolisi, processo di scissione dei carboidrati in piruvato, la cui reazione è stata riassunta sottostante.

Glucosio + 2NAD+ + 2ADP + 2Pi => 2Piruvato + 2NADH-H+ + 2ATP + 2H2O

Ma essendo la fermentazione anaerobica, di conseguenza avviene in assenza di ossigeno, come agente riducente del NADH-H+ si utilizza lo stesso piruvato prodotto dalla glicolisi, che viene convertito in lattato, come nell'immagine sopra [3].

Piruvato + NADH-H+ => Lattato + NAD+

Quindi l'intera fermentazione può essere riassunto nel seguente modo:

Glucosio + 2ADP + 2Pi => 2Lattato + 2ATP + 2H2O

Questa fermentazione è molto simile a quella alcolica dei lieviti, dove l'unica differenza sta nei prodotti. Esse vengono raggruppate nel percorso di Embden-Meyerhof, illustrata nell'immagine sottostante [5].

Fermentazione eterolattica

La maggior parte dei lattobacilli, però, quando fermenta non produce solo esclusivamente acido lattico, ma può produrre etanolo, acido acetico, acido formico e tutta una serie di sottoprodotti. Oltre a ciò sono in grado di fermentare sia gli esosi (glucosio, galattosio e fruttosio) che i pentosi (ribosio e xilosio).

Essendo la fermentazione mista, si parla di fermentazione eterolattica, la quale viene utilizzata da due gruppi di lattobacilli: gli eterofermentanti facoltativi, i quali se il substrato di cui si alimentano è ricco di zuccheri, fermentano omolatticamente, altrimenti in carenza di questi tendono a fermentare eterolatticamente, i lattobacilli appartenenti a questo gruppo sono i seguenti: l. casei, l. curvatus, l. paracasei, l. pentosus, l. plantarum, l. sakei; l'altro gruppo di lattobacilli sono gli eterofermentanti obbligati, che danno come prodotto di fermentazione esclusivamente acido lattico, etanolo e/o acido acetico, ad appartenere a questo gruppo sono i seguenti lattobacilli: l. brevis, l. buchneri, l. collinoides, l. fermentum, l. fructivorans, l. hilgardii, l. reuteri.

Il motivo per il quale questi batteri fermentando, producono oltre al lattato anche l'etanolo, risiede nella loro flessibilità di fermentare anche i pentosi. Infatti, nella scissione dei carboidrati non seguono la glicolisi, ma utilizzano la via dei pentosi fosfati unita alla fosfochetolasi

Infatti, una volta formato lo xilulosio-5-fosfato esso viene scisso dalla fosfochetolasi in gliceraldeide-3-fosfato e in acetil-fosfato, che andranno a formare rispettivamente lattato ed etanolo, come nell'immagine sottostante [4].

Viene utilizzata questa via metabolica, poiché gli eterofermentanti obbligatori non hanno l'enzima aldolasi che nella glicolisi scinde il fruttosio-1,6-difosfato in gliceraldeide-3-fosfato e diidrossiaceto fosfato. Mentre gli eterofermentanti facoltativi utilizzano normalmente la glicolisi e la via dei pentosi fosfati solo in determinati casi. 

• Glucosio + ATP + 2NAD+ + Pi => 

Gliceraldeide-3-fosfato + Acetil-fosfato + ADP + 2NADH-H+ + CO2

• Acetil-fosfato + 2NADH-H+ => Etanolo + 2NAD+ + Pi
• Gliceraldeide-3-fosfato + 2ADP + Pi => Lattato + 2ATP + H2O

Osservando sopra, la reazione di fermentazione eterolattica, convoglia gli NADH-H+ dalla via dei pentosi fosfati per ossidare l'acetil-fosfato e produrre etanolo, mentre quello derivato dalla conversione di gliceraldeide-3-fosfato in piruvato per ossidare questo e produrre lattato. Tutto ciò, partendo dal glucosio, si può riassumere nel seguente modo:

Glucosio + ADP + Pi => Lattato + Etanolo + CO2 + ATP + H2O

Mentre partendo dai pentosi come il ribosio, si ha:

Ribosio + ADP + Pi => Lattato + Etanolo + ATP + H2O

A conti fanti questo tipo di fermentazione dal punto di visto energetico rende pochissimo, una sola molecola di ATP per molecola di glucosio o ribosio. Ma il suo svantaggio è compensato con la possibilità di fermentare pentosi ed avere accesso a fonti energetiche diverse dagli esosi standard.

Fermentazione lattica bifidobatteri

I batteri appartenenti al genere bifidobacterium, fermentano i carboidrati eterolatticamente utilizzando una via di fosfatazione particolare, che produce acido acetico ed acido lattico, come nell'immagine sottostante [1].

Il processo vede due molecole di glucosio, le quali vendono convertite in due di fruttosio-6-fosfato come nella glicolisi, successivamente una di queste viene scomposta in acetil-fosfato ed eritrosio-4-fosfato, il quale viene addizionato all'altra molecola di fruttosio-6-fosfato e scomposta in triosio-fosfato ed eptosio-fosfato. Infine, queste serviranno a produrre due molecole di acetil-fosfato e due di gliceraldeide-3-fosfato.

2Glucosio + 2ATP + 3Pi => 3Acetil-fosfato + 2Gliceraldeide-3-fosfato + 2ADP

Il destino dell'acetaldeide-fosfato è quello di diventare acetato, mentre quello del gliceraldeide-3-fosfato segue lo stesso processo della fermentazione omolattica, quindi diventare inizialmente piruvato e successivamente lattato:

Acetil-fosfato + ADP => Acetato + ATP + H2O

Gliceraldeide-3-fosfato + 2ADP + 2Pi => Lattato + 2ATP + 2H2O

Quindi l'intero processo è molto vantaggioso poiché rende 2.5 molecole di ATP per ognuna di glucosio, come nella seguente reazione globale:

2Glucosio + 5(ADP + Pi) => 3Acetato + 2Lattato + 5(ATP + H2O)

Fermentazione acetica dei lattobacilli

Come detto all'inizio i lattobacilli sono batteri anaerobici aerotolleranti, cioè non riescono ad elaborare l'ossigeno ma ne tollerano la sua presenza. Questo perché non possiedono la catena di trasporto degli elettroni, però possono rigenerare la NADH-H+ riducendo l'ossigeno in acqua o perossido d'idrogeno.

Nell'immagine sopra [2], sono riportare le varie vie metaboliche del l. plantarum e si osserva che il destino del piruvato può essere molteplice.

Via acetica

Il piruvato viene ossidato dall'enzima piruvato ossidasi (POX) in acetilfosfato, il quale a sua volta attraverso l'acetato chinasi (AK) convertito in acetato con produzione di ATP.

Piruvate + H2O + O2 + ADP + Pi => Acetato + CO2 + H2O2 + ATP

Oppure il piruvato decarbossilato dall'enzima piruvato deidrogenasi (PDH) in acetil-CoA, il quale viene fosfato attraverso la fosfotransacetilasi (PTA) in acetilfosfato e produzione di acetato e ATP.

Piruvate + NAD+ + ADP + Pi => Acetato + CO2 + NADH-H+ + ATP

Via aceto-formica

In questo caso il piruvato viene decarbossilato dal piruvato formato liasi (PFL) in acetil-CoA con produzione di formato, e da qui proseguire con la via precedente.

Piruvate + ADP + Pi => Acetato + Formato + ATP

Rigenazione NADH-H+

In presenza di ossigeno da ridurre, ma non disponendo di una catena di trasporto degli elettroni, la NADH-H+ viene rigenerato attraverso due enzimi: la NADH ossidasi (NOX) e la NADH perossidasi (NPR). Le quali utilizzano rispettivamente le seguenti reazioni:

NADH-H+ + O2 => NAD+ + H2O2

NADH-H+ + H2O2 => NAD+ + 2H2O

Questa via metabolica permette a un eterofermetativo di ricavare almeno tre molecole di ATP per molecola di glucosio. Secondo le seguenti reazioni:

Glucosio + 2H2O + O2 + 3ADP + 3Pi => 2Acetato + 2CO2 + H2O2 + 3NADH-H+ + 3(ATP + H2O)

che riassunto diventa:

Glucosio + 2O2 + 3ADP + 3Pi => 2Acetato + 2CO2 + 4H2O + 3(ATP + H2O)

oppure si potrebbe avere:

Glucosio + 2O2 +  3ADP + 3Pi => 2Acetato + Formato + CO2 + H2O2 + 3(ATP + H2O)

Esistono diverse combinazioni di percorsi metabolici, atti a massimizzare la produzione di ATP, ma quelli illustrati sopra in linea di massima sono i più frequenti, da cui si evince che serve ossigeno affinché ciò avvenga, e da cui si capisce che queste non sono vere e proprie fermentazioni, ma come con quella acetica si ha una respirazione.

Bibliografia

[1] Ciani M., Comitini F, e Mannazzu I; Fermentation; Encyclopedia of Ecology, Volume 2, 2013, Pages 310-321;

[2] Quatravaux S., Remize F., Bryckaert E., Colavizza D. and Guzzo J.; Examination of Lactobacillus plantarum lactate metabolism side effects in relation to the modulation of aeration parameters; Journal of Applied Microbiology ISSN 1364-5072

[3] https://library.weschool.com/lezione/come-la-cellula-fermenta-zucchero-ad-alcol-e-acido-lattico-4307.html

[4] http://www.biosciencenotes.com/heterolactic-phosphoketolase-pathway/

[5] https://textbookofbacteriology.net/metabolism_3.html

Le informazioni presenti su questo blog sono a scopo informativo, quindi mi esento da qualsiasi responsabilità per i danni che potreste causare.

Agrumi

Credo che molti di voi spesso si sono chiesti il dosaggio delle bucce di agrume nelle birre, o almeno quale fosse quello di partenza per una ricetta. Per questo vi darò dei consigli basati sulle mie esperienze e i vari dati raccolti su internet.

• Primo consiglio, volate basso, non strafate, se non conoscete il dosaggio partite da 0.2 - 0.4g/l di bucce secche finemente macinate, poi andate a salire in base ai vostri gusti.
• Secondo consiglio, le vostre bucce devo essere abbastanza fresche o almeno ben conservate, poi se come me avete accesso ad agrumi freschi ancora meglio. La conversione da secco a umido (fresco) è generalmente di 1:4, o di 1:0.25 se volete sapere a quanto equivalgono le bucce fresche in secche.
• Terzo consiglio, non tutte le bucce danno lo stesso contributo aromatico, alcune come quelle di mandarino o di pompelmo sono più delicate e hanno bisogno di un dosaggio più alto.

Fatte queste premesse volevo condividere i dosaggi che generalmente vengono consigliati delle varie bucce di agrume secche.

Arancia amara, la buccia di questo agrume regna sovrana tra le birre belghe, infatti, una witbier non sarebbe tale se non ne contenesse almeno 0.5g/l, mentre nelle saison non è obbligatoria ma a mio parere 0.7g/l ci stanno bene.

Arancia dolce e Chinotto, la buccia di questo agrume invece l'ho sempre vista come una sorella minore di quella amara, ma non per questo 0.5g/l ci stanno bene in una saison.

Bergamotto, questo agrume è molto inteso tant'è che ne bastano tra 0.2 e 0.4g/l per dare un forte aroma citrico ad una birra.

Cedro e Limone e Lime, questi essendo molto simili tra loro li ho messo insieme, le loro bucce sono poco utilizzate, ma utili per sostituire il coriandolo, infatti, ne bastano 0.5g/l per avere un buon aroma di limone.

Fortunella, agrume delicato, con la cui buccia si possono partire con dosi intorno tra 0.4 - 0.8g/l.

Limetta, agrume dalla buccia simile ad un mandarino e profumatissima, che sa fortemente di limone, può essere utilizzata come sostituta di quest'ultimo, per questo raccomando 0.4g/l.

Mandarino, agrume la cui buccia è meno citrica dell'arancia, che compensa con il suo profumo inconfondibile e per questa si consiglia un dosaggio tra 0.8 e 1.6g/l.

Mandarancio, agrume più intenso del comune mandarino e che si avvicina ad una arancia, del quale ne bastano 0.4 - 0.5g/l per farsi sentire.

Pomelo e Pompelmo, agrumi molto simili e delicatissimi, per i quali si consigliano dosi tra 0.8 e 1.6g/l di buccia.

Ponciro, agrume dall'aroma prepotente del quale ne bastano 0.2g/l per un buon contributo citrico all'interno delle birre.

Le informazioni presenti su questo blog sono a scopo informativo, quindi mi esento da qualsiasi responsabilità per i danni che potreste causare.

Fermentazione acetica

Se una bevanda alcolica prende aria si sa, diventa aceto, questo fenomeno è causato dalla fermentazione acetica, processo metabolico aerobico, che ossida l'etanolo in acido acetico, semplice acido carbossilico. Questa fermentazione viene utilizzata principalmente dai batteri appartenenti alla famiglia degli acetobacteraceae, ma può essere utilizzata dai brettanomyces o da alcuni lattobacilli.

C2H6O + O2 => C2H4O2 + H2O + (energia)

Chiamarla fermentazione è un termine improprio in quanto la produzione di acido acetico avviene per ossidazione dell'etanolo e riduzione dell'ossigeno, come con la respirazione o meglio con la glicolisi aerobica.

Nell'immagine sovrastante [4], è illustrato l'intero processo di fermentazione acetica, che inizia con la deidrogenazione dell'etanolo in acetaldeide ad opera del nostro caro alcool deidrogenasi e la riduzione del PQQ in PQQH2. Questa è la pirrochinolina chinone (pyrroloquinoline quinone) un cofattore redox utilizzato dai batteri per la deidrogenazione e quindi l'ossidazione delle sostanze, in pratica lavora alla stessa maniera della NAD+. 

Dopo la produzione di acetaldeide, questa viene idratata e successivamente ossidata ad acido acetico, per opera dell'acetaldeide deidrogenasi con l'ausilio della PQQ. L'intera reazione di ossidazione si può riassumere nel seguente modo:

Etanolo + 2PQQ + H2O => Acido Acetico + 2PQQH2

Mentre la rigenerazione della PQQ avviene lungo la catena di fosforilazione ossidativa, seguendo la reazione:

PQQH2 + 1/2O2 + 3ADP + 3Pi => PQQ+ + 3ATP + 4H2O

Di conseguenza l'intero processo si può riassumere nel seguente modo:

Etanolo + O2 + 6ADP + 6Pi => Acido Acetico + H2O + 6(ATP + H2O)

A conti fatti questa via metabolica è molto vantaggiosa in quanto per ogni molecola di etanolo se ne producono sei di ATP, ma implica la presenza di ossigeno; ecco perché sia vino che birra se vengono arieggiati troppo possono acquisire lo spunto acetico.

Le altre vie metaboliche degli acetobatteri

Gli acetobatteri non ricavano energia esclusivamente dall'etanolo, in quanto non è facilmente reperibile in natura, ma possono utilizzare come fonte tutta una serie di carboidrati come gli esosi (glucosio e fruttosio) e i pentosi (ribosio e xilosio). Questo perché non li scindono attraverso la glicolisi, bensì, utilizzano come la maggior parte dei batteri, la via dei pentosi fosfati 

Questa via metabolica, illustrata sopra [5], è composta da due fasi. Una ossidativa, a sua volta composta da tre passaggi enzimatici atti a convertire gli esosi in pentosi fosfati; mentre l'altra fase è non-ossidativa, composta da una serie di passaggi enzimatici che permette di avere dal ribulosio-5-fosfato gliceraldeide-3-fosfato e fruttosio-6-fosfato e viceversa.

Quindi la prima fase si potrà riassumere con la seguente reazione:

Glucosio-6-fosfato + 2NADP+ + H2O  => Ribulosio-5-fosfato + 2NADPH-H+ + CO2

Mentre la seconda può essere riassunta nel seguente modo:

3Ribulosio-5-fosfato <=> 

Ribosio-5-fosfato + 2Xilulosio-5-fosfato <=> 

Gliceraldeide-3-fosfato + 2Fruttosio-6-fosfato

In questo processo appare un nuovo cofattore redox la NADP+ (nicotinammina adenin dinucleotide fosfato), la quale si riduce in NADPH-H+ quando deidrogena una molecola, lavorando allo stesso modo della NAD+.

Comunque la via dei pentosi viene utilizzata dagli acetobatteri per la produzione dai carboidrati di gliceraldeide-6-fosfato, come con la glicolisi, e da esso produrre piruvato che andrà ad alimentare il ciclo dell'acido citrico (TCA cycle), come con la respirazione aerobica. 

L'intero processo metabolico di questi batteri è riassunto nell'immagine sottostante [2].

In tutto questo splendido meccanismo c'è un intoppo, se il substrato di crescita degli acetobatteri è ricco di etanolo, gli enzimi che permettono il ciclo dell'acido citrico non vengono sintetizzati e quindi non si ha l'ossidazione del piruvato o dell'acetato in anidride carbonica.

Per ovviare a ciò questi batteri ossidano l'etanolo in acetato, in modo da abbassarne la concentrazione e solo successivamente attivare la sintesi degli enzimi del ciclo TCA e ossidare ulteriormente l'acetato, nel seguente modo:

Acetato + CoA => Acetil-CoA + H2O

Acetil-CoA + 2H2O + 3NAD+ + FAD + ADP + Pi => 2CO2 + CoA + 3NADH-H+ + FADH2 + ATP

Tutto ciò in presenza di ossigeno e ossidando i cofattori redox attraverso la fosforilazione ossidativa, si avrà:

Acetato + H2O + 5/2O2 + 12(ADP + Pi) => 2CO2 + 5H2O + 12(ATP + H2O)

Quindi una bevanda acetica con il tempo tenderà a diventare acquosa, in quanto l'acido acetico viene ossidato, questo processo è molto lento poiché l'ossigeno deve diffondere nel liquido e tutto dipende dall'area della superficie di contatto tra il liquido stesso e l'atmosfera. Se quest'area è piccola l'ossidazione della bevanda in acetica avverrà lentamente e ancora più tempo ci vorrà per renderla acquosa, ciò spiega perché il collo di bottiglie e damigiane è tendenzialmente stretto. Mentre se si vuole produrre dell'aceto bisogna aumentare la superficie di contatto e una volta prodotto va imbottigliato.

Fermentazione acetica dei brettanomyces

Come detto all'inizio oltre agli acetobacter esistono i brettanomyces che sono in grado di fermentare il glucosio in acido acetico. Secondo la seguente formula [1]:

Glucosio + bO2 => aBiomassa + cCO2 + (-0.6b + 0.569)Etanolo + (0.6b + 0.022)Acetato

Quindi come si può osservare nell'immagine accanto [3] si possono avere vari processi metabolici dei brettanomyces e nella parte sottostante si ha un grafico che mostra le condizioni le condizioni in cui avvengono le varie vie metaboliche.

Come con i saccaromyces in condizioni aerobiche  possono utilizzare il TCA per produrre energia e moltiplicarsi. Con il consumo di ossigeno e quindi con l'avvicinarsi delle condizioni anaerobiche la cellula inizia a fermentare etanolo e parallelamente  acido acetico attraverso l'acetaldeidei deidrogenasi.

Acetaldeide + H2O + NADP+ 

=> Acetato + NADPH-H+

Una volta passati dalle condizioni aerobiche a quelle anaerobiche la cellula di brettanomyces inizia la fermentazione alcolica fino al completo consumo degli zuccheri del substrato.

Bibliografia

[1] Aguilar Uscanga M. G., Délia M.-L., Strehaiano P.; Brettanomyces bruxellensis: effect of oxygen on growth and acetic acid production; 14 January 2003 Springer-Verlag 2003;

[2] Kazunobu Matsushita, Hirohide Toyama, Naoto Tonouchi, Akiko Okamoto-Kainuma; Acetic Acid Bacteria; Springer; 2016;

[3] Steensels J., Daenen L, Malcorps P., Derdelinckx G, Verachtert H., Verstrepen K. J.; Brettanomyces yeasts—Fromspoilage organisms to valuable contributors to industrial fermentations; 2015 Published by Elsevier B.V.;

[4] http://lamanna-antonino-chimica.weebly.com/fermentazione-acetica.html;

[5] https://www.tuscany-diet.net/2018/09/01/pentose-phosphate-pathway/.

Le informazioni presenti su questo blog sono a scopo informativo, quindi mi esento da qualsiasi responsabilità per i danni che potreste causare.